Proteomic Pathology

Die Forschung in der Pathologie analysiert die zellulären Vorgänge, die zur Entstehung und Progression von Krankheiten führen. In diesem Zusammenhang werden Zellen und Gewebe zunehmend als ein kompliziertes Netzwerk verstanden, in dem eine Vielzahl biologischer Prozesse gleichzeitig ablaufen und gemeinsam das biologische Verhalten bestimmen. Proteine sind an allen zellulären Prozessen beteiligt und somit sind zum Verständnis der zellulären Funktionen das Verständnis der zeitlich und örtlich differentiellen Protein- Expression, der Protein-Lokalisation, der Protein-Interaktion, der posttranslationalen Protein- Modifikation und der Protein-Aktivität essentiell.

 

Quantitative massenspektrometrische Analysen an Paraffinmaterial: Proteine aus fixierten Tumorproben werden mit einem Protein-Vergleichsstandard vermischt. Der Proteinvergleichsstandard wird aus Zell-Linien gewonnen, die mittels des SILAC-Prinzips markiert wurden. Es ergibt sich für jedes Protein jeder Gewebeprobe eine Ratio von „Gewebe zu Standard“. Diese Ratios sind untereinander vergleichbar, da jeweils zum gleichen Standard quantifiziert wurde.

Quantitative Massenspektrometrie

 

Die globale Analyse der zellulaäen Proteinzusammensetzung würde die Sichtweite auf das zelluläre Netzwerk sehr erweitern, ist technisch jedoch anspruchsvoll. Ein großer Durchbruch in diese Richtung war die Einführung von Microarrays zur globalen Quantifizierung der mRNA-Expression. Obwohl dies zu einem starken Anstieg in unserem Wissen über viele zellulären Funktionen geführt hat, wäre die direkte Untersuchung der Proteinexpression häufig vorteilhaft, weil die mRNA- oft nicht gut mit der Proteinexpression korrelliert und posttranslationale Proteinmodifikationen wie Phosphorylierung mit Microarrays nicht erfasst werden können. Die Massenspektrometrie stellt eine Technologie dar, die es erlaubt, Proteine direkt, global und unvoreingenommen zu untersuchen.

 

Für die massenspektrometrischen Analysen von Gewebs- und Zelllysaten arbeiten wir in enger Kooperation und vielen gemeinsamen Projekten mit Dr. Christof Lenz und Prof. Dr. Henning Urlaub von der Proteomanalyse-Facility, Universitätsmedizin Göttingen und der Bioanalytischen Massenspektrometrie am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen, wo die Analysen erfolgen, und mit Dr. Thomas Oellerich und Prof. Dr. Hubert Serve von der Medizinischen Klinik II, Universitätsklinikum Frankfurt zusammen.

 

Allgemeine Einführung in die proteomische quantitative Massenspektrometrie

Das zu untersuchende Proteingemisch wird zur massenspektrometrischen Analyse zunächst proteolytisch verdaut und die Peptide mittels Elektrospray-Ionisierung (ESI) ionisiert. In einem Orbitrap Massenspektrometer oszillieren die Peptide in einer bestimmten, von Masse und Ladung des Peptides abhängigen Frequenz um eine Ionenfalle. Dadurch können die Masse im Verhältnis zur Ladung (m/z) und die Intensität jedes Peptides bestimmt werden. In einem zweiten Messschritt wird die Sequenz des Peptides bestimmt, was als MS/MSAnalyse bezeichnet wird. Dazu werden die Peptide zunächst in eine Kollisionskammer überführt, wo sie fragmentiert werden. Durch die erneute Messung der Masse der Bruchstücke kann die Aminosäuresequenz des Peptides bestimmt werden. Dadurch ergibt sich der besondere Vorteil, dass a priori nicht bekannt sein muss, welche Proteine gemessen werden sollen, sondern das Massenspektrometer potentiell jedes beliebige Protein identifizieren kann.


Häufig ist jedoch wichtiger, in welchem Ausmaß sich die Menge eines Proteins in zwei unterschiedlichen Konditionen unterscheidet, als die bloße Anwesenheit eines Proteins nachzuweisen. Eine Möglichkeit, quantitative Messungen durchzuführen, ist das stable isotope labeling of amino acids in cell culture, kurz SILAC. Dabei werden die zu untersuchenden Zellen mit unterschiedlich schweren Aminosäuren kultiviert.

Der Massenunterschied wird dabei durch den Einbau von stabilen, schweren Isotopen von Kohlen-, Stick- oder Wasserstoff in die Aminosäuren Arginin und Lysin erreicht. Durch die Kultivierung einer Kontrollzelllinie mit leichten Aminosäuren kann ein relativer Vergleich von zwei verschiedenen Versuchsbedingungen erzielt werden, da sich die Peptide durch den resultierenden Massenunterschied im Massenspektrometer unterscheiden lassen.


Auch die Analyse von posttranslationalen Proteinmodifikationen wie Phosphorylierung ist mittels Massenspektrometrie möglich, da jede Modifikation zu einer definierten Massenänderung führt. Dieser Massenunterschied kann im MS/MS-Modus einer spezifischen Aminosäure zugeordnet werden. Durch die Kombination mit dem SILAC-Prinzip ist es über die reine Identifikation von Phosphorylierungsstellen hinaus auch möglich, Phosphorylierungsunterschiede zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen zu bestimmen.

 

Menschliches Gewebe, wie es zur Routine-Diagnostik in die Pathologie kommt, lässt sich nicht mehr mittels des SILAC-Prinzips markieren. Dennoch sind quantitative massenspektrometrische Analysen möglich. Dafür werden zunächst die Proteine aus den Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetten Gewebsblöcken isoliert und mit einem Protein-Vergleichsstandard vermischt. Der Proteinvergleichsstandard wird aus Zell-Linien gewonnen, die mittels des SILAC-Prinzips markiert wurden. Es ergibt sich für jedes Protein jeder Gewebeprobe eine Ratio von „Gewebe zu Standard“. Diese Ratios sind untereinander vergleichbar, da jeweils zum gleichen Standard quantifiziert wurde.

 

Ein PamChip enthält 144 gespottete Peptide, die von der Kinaseaktivität in einem Zell- oder Gewebslysat phosphoryliert werden können. Mittels Fluoreszenzfarbstoff-markierter Antikörper kann die Aktivität der Kinasen im Lysat bestimmt werden.

Kinaseaktivität - PamGene

Die Aktivität eines Proteins wird von einer Vielzahl von Faktoren wie Expression, verschiedenen posttranslationalen Modifikationen oder Interaktion mit anderen Proteinen reguliert. Häufig stellt die abberante Aktivität von onkogen-wirksamen Kinasen eine Schlüsselrolle in der malignen Entartung einer Zelle dar. Ebenso ist es die Aktivität einer Kinase, die entscheidend ist für das Ansprechen auf einen spezifischen Kinase-Inhibitor als gezielte Krebs-Therapie.

Bei der Kinaseaktivitätsmessung mittels PamChips der Firma PamGene werden Peptide durch die Kinaseaktivität des zu untersuchenden Lysates phosphoryliert und mittels Fluoreszenzfarbstoff-markierter Antikörper sichtbar gemacht. Der Vorteil dabei ist, dass direkt die Aktivität der Kinasen im Lysat bestimmt wird. Ein weiterer Vorteil ist, dass Inhibitoren mit in das Lysat gegeben werden können, so dass direkt das Ansprechen auf einen spezifischen Kinaseinhibitor beobachtet werden kann.

Aktuelle Projekte

Aktuell werden in unserer Arbeitsgruppe mit den genannten Methoden verschiedener histologische und molekulare Subtypen des Lungenkrebs analysiert. Dabei arbeiten wir mit Dr. Alexander Emmert, Dr. Mark Hinterthaner, PD Dr. Bernd Danner und Prof. Dr. med. Dipl. Phys. Friedrich A. Schöndube von der Klinik für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie zusammen. In Zukunft sollen die proteomischen Analysen auf weitere Malignom-Entitäten ausgedehnt werden.

 

 

 

KOOPERATIONEN

 

Proteomische Massenspektrometrie

 

Jasmin Corso

Prof. Dr. Henning Urlaub

Bioanalytische Massenspektrometrie Gruppe

Max Planck Institut für biophysikalische Chemie Göttingen

https://www.mpibpc.mpg.de/de/urlaub

 

Dr. Christof Lenz

Prof. Dr. Henning Urlaub

Proteomics Service Facility

Universitätsmedizin Göttingen

http://www.med.uni-goettingen.de/de/content/forschung/1998.html

 

Dr. med. Thomas Oellerich

Prof. Dr. med.  Hubert Serve

Medizinischen Klinik II – Hämatologie und Onkologie

Universitätsklinikum Frankfurt

http://www.kgu.de/?id=3102

 

 

 

 

Funktionelle Bildgebung

 

Dr. Gertrude Bunt

Institut für Neuropathologie

Molecular and Optical Live Cell Imaging

Universitätsmedizin Göttingen

http://www.med.uni-goettingen.de/de/content/forschung/6656.html

 

Prof. Dr. Fred Wouters

Institut für Neuropathologie

Laboratory for Molecular and Cellular Systems

Universitätsmedizin Göttingen

http://www.uni-goettingen.de/de/58060.html

 

 

Thorax-Herz-Gefäßchirurgie

 

Dr. med. Alexander Emmert

Dr. med. Marc Hinterthaner

PD Dr. med. Bernd Danner

Prof. Dr. med. Dipl. Phys. Friedrich A. Schöndube

Klinik für Thorax-, Herz- und Gefäß-Chirurgie

Universitätsmedizin Göttingen

http://thg.med.uni-goettingen.de/index.php/de/

 

 

 

Ansprechpartner / Kontakt

 

Dr. med. Hanibal Bohnenberger

Assistenzarzt 
Telefon: 0551-39-22107

Pieper: 919-2561

hanibal.bohnenberger@med.uni-goettingen.de

Publikationen zum Thema

Oellerich T, Oellerich MF, Engelke M, Münch S, Mohr S, Nimz M, Hsiao HH, Corso J, Zhang J, Bohnenberger H, Berg T, Rieger MA, Wienands J, Bug G, Brandts C, Urlaub H, Serve H. (2013) β2 integrin-derived signals induce cell survival and proliferation of AML blasts by activating a Syk/STAT signaling axis. Blood;121(19):3889-99, S1-66

Lösing M, Goldbeck I, Manno B, Oellerich T, Schnyder T,   Bohnenberger H, Stork B, Urlaub H, Batista FD, Wienands J, Engelke M. (2013) The Dok-3/Grb2 protein signal module attenuates Lyn kinase-dependent activation of Syk kinase in B cell antigen receptor microclusters. J Biol Chem;288(4):2303-13

Oellerich T, Bremes V, Neumann K, Bohnenberger H, Dittmann K, Hsiao HH, Engelke M, Schnyder T, Batista FD, Urlaub H, Wienands J. (2011) The B-cell antigen receptor signals through a preformed transducer module of SLP65 and CIN85. EMBO J;30(17):3620-34


Bohnenberger H, Oellerich T, Engelke M, Hsiao HH, Urlaub H, Wienands J. (2011) Complex phosphorylation dynamics control the composition of the Syk interactome in B cells. Eur J Immunol;41(6):1550-62